Описание бактериоскопического метода исследования и его виды

24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологиче­ская, генетическая.

Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребно­стям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адек­ватно редуцированными

сахарный кровяной агар в чашки Петри, в высо­кий столбик сахарного питательного агара или другие среды для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэробных условиях из образовавшихся колоний бактерий го­товят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта — Тароцци и агаровые среды для выделения чистой культуры.

При выделении спорообразующих анаэробных бактерий (кло­стридии) первоначальные посевы прогревают на водяной бане при температуре 80 °С в течение 20 мин для уничтожения веге­тативных клеток посторонней микрофлоры, которая может при­сутствовать в исследуемом материале

Идентификация – это определение систематического положения, выделение из какого-либо источника до уровня вида или варианта.

25. Биохимический метод идентификации: определение протеолитических. сахаролитических, липолитических свойств, выявление гемолизинов и оксидоредуктаз. Использование автоматических микробиологических анализаторов.

Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных

продуктов.

а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;

б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);

в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).

б)расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза.

в) расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;

г) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S, как Продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H2S выявляется и в среде Олькеницкого;

д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака.

Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид. В этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.

Ферменты-токсины: Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают b-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, а-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как д-гемолиз.

Цитотоксины- ферменты, оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Например, цитотоксичность токсина анаэробных микрорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 г материала (испражнения или др.

) разводят в фосфатном буфере 1:10 масса/объем, центрифугируют ЗО мин при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм, вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37°С 24-48 часов до достижения токсического эффекта.

Иммунохимическое определение продукции токсинов: используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов -дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.

Ппазмокоагулаза- фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба.

1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).

2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.

3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки).

К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.

4. Определение спектра короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК),Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты, включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода.

Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую кислоты. Для определения КЦЖК используют метод газожидкостной хроматографии.

Колонии ---- Приготовление ---- Внесение ----- Инкубация ---- Учет( -) ---- Интер-

суспензии суспензии 4 часа 37°С претация в среду

В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы.

Планшета со стрипами инкубируется при 37°С 4 часа. Учет может осуществляться автоматически (используя прибор "АТВ") или визуально Результат биохимической реакции оценивают в виде " " или "-" и вносят о референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специапьно разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот ипи иной

микроорганизм.

I. Паспортная часть

Фамилия, имя, отчество _____________________________________________________________

_____________________________________________________________

Возраст _______________________

Дата поступления______________________________________________

Профессия ___________________________________________________

Место работы_________________________________________________

Семейное положение___________________________________________

Диагноз при поступлении_______________________________________

Клинический диагноз ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Сопутствующие заболевания ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Оперативные вмешательства (название операции, дата)________________________________________________________________________________________________________________________________Осложнения после операции _________________________________________

__________________________________________________________________

Исход болезни (выздоровление, улучшение, без перемен, ухудшение, смерть) __________________________________________________________________

30. Молекулярная гибридизация. Полимеразная цепная реакция.

выявление степени сходства различных ДНК Применяется для идентификации микроорганизмов, особенно тех, которые трудно и медленно растут (микоплазмы. хламидии. вирусы )

- в растворе,

- на фильтре,

- на стекле.

Зонд - это двухцепочечные или одноцепочечные фрагменты ДНК меченые затонной, флюорисцентной или ферментной.

• индикация микроорганизмов в объектах внешней среды, пищевых продуктов, материале от больных,

• идентификация микроорганизмов.

• генетическое типирование,

• исследуемая проба ДНК;

• смесь ДНТФ (дезоксинуклеотилтрифосфат),

• праймеры - синтетические фрагменты ДНК;

• специфический буфер;

• минеральное масло;

• мембрана.

III. Анамнез данного заболевания

(когда и как началось заболевание, как развивалось, с чем связывает, где и как лечилась. Жалобы на расстройство функций других систем)

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1. Семейный анамнез и наследственность (заболевание в семье злокачественными новообразованиями, болезнями обмена, психическими, венерическими, туберкулезом и пр.) __________________________________

2.Профессиональный анамнез (профессия, вредные влияния, вынужденное положение тела и пр.) _______________________________________________

3. Вредные привычки: курение, алкоголь, наркомания ____________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Как росла и развивалась в детстве, какой по счету родилась, условия жизни, занятия в школе

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Перенесенные заболевания: нервные и психические, острые инфекционные, венерические, детские инфекции, ревматизм, болезнь Боткина, туберкулез, болезни обмена

_____________________________________________________________

6. Были ли гемотрансфузии, осложнения

7. Получала ли антибиотики и препараты коры надпочечников________________________________________________

8. Аллергологический анамнез

9. Менструальная функция (возраст менархе, когда установился регулярный менструальный цикл, продолжительность менструального цикла и менструаций, болезненность, объем кровопотери. Дата последней менструации)

10. Половая функция (с какого возраста половая жизнь, регулярность, постоянный или нет половой партнер. Особенности половой жизни: боли во время полового сношения, контактные кровотечения, использование противозачаточных средств)

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

11. Секреторная функция (бели, их характер, время появления, количество)

__________________________________________________________________________________________________________________________

12. Детородная функция (на каком году половой жизни наступила первая беременность, ее исход. Сколько было беременностей и чем они заканчивались: абортом, родами. Особенности течения родов и послеродового периода. Осложнения после абортов.

13. Гинекологические заболевания в анамнезе

___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Инфекция (лат. infectio— заражение), или инфекционный процесс, представляет собой совокупность физиологических и патологических адаптационных и репарационных реакций, которые возникают и развиваются в макроорганизме в процессе взаимодействия с патогенными микроорганизмами, вызывающими нарушения его внутренней среды и физиологических функций.

Отличия инфекционных заболеваний от неинфекционных:

  1. Причина заболевания – живой агент, при этом каждая болнзнь имеет своего возбудителя.

  2. Сложные процессы взаимодействия между патогенными микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности – токсинами, ферментами – с одной стороны, и клетками, тканями и органами организма хозяина с друой.

Условия возникновения:

  1. Инфицирующая доза заболевания – минимальное количество микробных клеток, способных вызвать инфекционный процесс.

  2. Микроб должен попасть во входные ворота, т.е. орган в котором он может размножаться.

  3. Патогенность - способность микроба вызывать инфекционный процесс у хозяина.

  4. Степень патогенности – вирулентность – индивидуальный штаммовый признак.

Типы инфекций:

  1. В зависимости от хозяина:

а) инф. растений;

б) инф. животных;

в) инфекции людей

  1. В зависимости от возбудителя:

а) бактериозы

б) микозы

в) вирусные болезни

г) протозоозы

д) паразитозы

  1. В зависимости от тяжести:

а) микробоносительство

б) бессимптомные формы инфекций (латентная)

в) сама инфекция.

  1. По длительности течения:

а) острые инфекции – короткий инкубационный период, выражены признаки заболевания, относительно короткое течение (2-3 месяца). Иммунный ответ хорошо выражен. (ангина)

б) первично-хронические инфекции – длительный инкубационный период, медленное начало, нет цикличности, иммунный ответ слабо выражен. (склерома)

в) вторично, или острохронические. 1-я стадия протекает остро, часть больных выздоравливает, а у части болезнь переходит в хроническую форму.

г) меделенные инфукции – вирусной или преонной этиологии. 100% летальность (СПИД).

  1. По кратности заражения:

а) инфекция с однократным заражением организма

б) суперинфекция – заражение тем же микробом, но до выздоровления.

в) реинфекция – заражение тем же микроорганизмом, но после выздоровления.

г) рецидив – возврат клинических проявлений болезни без повторного заражения за счет оставшихся в организме возбудителей. (остеомиелит, возвратный тиф).

  1. По числу возбудителей:

а) моноинфекции

б) смешанные инфекции

в) вторичная ифекция – вторичное заражение другим микробом на фоне продолжительного заболевания.

  1. По пути проникновения:

а) экзогенная

б) эндогенная – активация микроба, содержащегося в организме.

в) аутоинфекция – за счет микробов, составляющих микрофлору.

  1. По месту заражения:

а) внебольничные

б) внутрибольничные

  1. По источнику заражения:

а) антропонозы (корь, коклюш)

б) зоонозы – истинные инфекции животных.

в) сапронозы – истинные заражения – внешняя среда.

24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологиче­ская, генетическая.

продуктов.

микроорганизм.

  1. Естественная

  2. Приобретенная:

а) фенотипическая

б) генотипическая – связана с изменением генетической активности, носит стойкий наследственный характер.

Пути возникновения:

  1. Спонтанные мутации в ДНК

  2. эписомальный или плазмидный (наличие Rплазмиды)

Культура считается устойчивой, если ее рост не подавляется теми минимальными концентрациями АБ, которые обычно подавляют бактерии этого вида.

Биохимические аспекты устойчивости:

  1. Синтез ферментов, разрушающих АБ

  2. Модификация мишени, на которую действуют антибиотики.

  3. Изменение проницаемости клеточной стенки для антибиотика

  4. Повышение скорости выведения антибиотика

  5. Повышение скорости продукции субстрата.

39 Методы изучения чувствительности микробов к антибиотикам.

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам применяют три метода: диффузии препарата в агар из бумажных дисков, серийных разведений в бульоне и в плотной питательной среде. Имеются также ускоренные методы.

В качестве критерия чувствительности микробов к антибиотикам избирают их терапевтические концентрации в крови и других биотопах животного организма после введения определенных доз препарата Мерой чувствительности микробов является минимальная концентрация препарата (мкг/ед/мл), которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта (минимальная подавляющая концентрация - МПК).

Метод бумажных дисков Для его проведения нужны стандартные заводские диски, пропитанные антибиотиками в определённой концентрации, и стандартная питательная среда. Из суточной микробной культуры готовят взвесь на физрастворе (густота 1 млрд микробных тел в I мл), которую затем разводят в 10 раз.

На поверхность плотной среды наливают 1-2 мл указанной культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности среды Остаток удаляют пипеткой. Среду подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки Инкубируют в термостате при 37°С - 24 часа

Учет: в падающем свете на фоне темной поверхности измеряют диаметр (с учетом диаметра диска) задержки роста. Оценку результатов проводят по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны н таблице. Культуру относят к одной из трех категорий.

чувствительная, умеренно-чувствительная и устойчивая Укачанные категории предложены клинической химиотерапией, исходя из отношения между МПК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз.

К чувствительным относят культуры, рост которых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в сыворотке крови больного в процессе назначения обычных доз антибиотика Умеренно-устойчивыми считаются культуры, подавляемые концентрациями, которые могут быть достигнуть при введении максимальных доз препарата.

Указанный метод является полу количественным. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведений. Метод серийного разведения антибиотика в бульоне. Готовят ряд убывающих разведений антибиотика в пробирках с бульоном (кратные 2) и добавляют испытуемую культуру.

Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотика Через сутки инкубации в термостате определяют МПК. которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста.

Для определения бактерицидного действия из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на сектора чашки Петри с МПА. За бактерицидную концентрацию принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из которой не дал роста.

Метод серийных разведений в плотной питательной Среде. Этот метод более чувствителен и точен. Каждый антибиотик испытывают в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару.

Агар с антибиотиками разливают в три чашки Петри (по одной чашке на каждую концентрацию). Контролем служит чашка с агаром без антибиотика. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотика 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе).

Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет ни одной колонии. Микроорганизмы, рост которых подавлен всеми 3 концентрациями, рассматривают как чувствительные (в этом случае можно применять антибиотик в терапевтической дозе);

2-й и 3-й концентрациями как среднечувствительные (антибиотик можно применять только в увеличенной дозе); 3-й как умеренно-устойчивые микроорганизмы (антибиотик можно применять только местно); растущие на всех трех концентрациях, относят к устойчивым (антибиотик нельзя применять).

Ускоренные методы. Позволяют получить результат через 3-4 часа. Чаше всего пользуются методом. основанным на изменении окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) среды в процессе роста микроба в присутствии антибиотика

Ход работы: при использовании метода бумажных дисков или серийных разведений антибиотика в агаре через 4-6 часов роста культуры поверхность чашки обрабатывают индикатором, реагирующим на ОВП среды (тетразолий хлорид).

В местах роста микроба среда окрашивается в красный цвет, при отсутствии роста микроба цвет среды не меняется. Учет и критерии оценки, как и при обычных методах. В последние годы разработана специальная тест-система ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (посев тест-микроба в жидкую среду с антибиотиком, инкубация 4-6 часов с последующим определением прироста мутности раствора опытных образцов в сравнении с контрольными).

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Полуколичественный - диффузии в агар с применением бумажных дисков с антибиотиками. Учет -

диамметр зон задержки роста микроорганизмов вокруг диска. Оценка: устойчивость - отсутсвие зоны;

малая чувствительность - зона до 10 мм; чувствительность - зона более 10 мм Задача выбрать

эффективный аппарат.

а) разведение антибиотиков в мясо-пептонном бульоне;

б) разведение антибиотиков в мясо-пептонном агаре.

Учёт - наличие или отсутствие роста микробов в питательной среде с различными концентрациями препарата.

а) полуколичественный с дисками и индикаторами. Оценка - диаметр неокрашенных зон вокруг дисков

б) количественный разведение антибиотиков в МБП с углеводами и РН- индикаторами. Оценка- изменение цвета среды в пробирках

XII. Лечение

(Показания к операции, лекарственные препараты, дозы. Физиотерапвтическое лечение и т.д.)

Если больная была прооперирована, то необходим протокол операции

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

XIII. Послеоперационный период (описать состояние больной в течение 2-х суток)

___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Поделитесь с друзьями!
Vk
Send
Klass